Diagnosis Laboratorium Hepatitis Virus dengan Penanda Virus Hepatitis

1. Apakah yang dimaksudkan dengan hepatitis?
Hepatitis atau radang hati dapat berupa kelainan proses akut dan kronis. Hepatitis akut bila peradangan hanya berlangsung singkat dan dianggap kronis bila sampai lebih dari 6 bulan proses masih terus berlangsung baik berupa peradangan, kelainan uji fungsi hati atau menetapnya HBsAg+ dan anti-HCV+. Hepatitis dapat berlanjut menjadi sirosis hati, hepatoma atau karsinoma hati primer sampai gagal hati. ²

2. Apa saja penyebab hepatitis?
Penyebab hepatitis ada banyak ragamnya, tetapi yang utama terbanyak adalah kelompok virus hepatitis yaitu virus hepatitis A, B, C, D, E, F, G, H dan TT. Penyebab lain adalah virus-virus lain seperti Sitomegalovirus (CMV), Epstein-Barr (EB), Herpes-Varicella (HV), juga bakteri misalnya Salmonela pada demam tifoid, beberapa parasit, bahan toksik seperti obat-obatan, alkohol, toksin, serta kelainan imunitas otoantibodi. ^1,2

3. Apa saja jenis virus hepatitis terutama yang dikenal di Indonesia?
Dari sekian banyak jenis virus hepatitis yang telah diketahui maka yang pernah dilaporkan di Indonesia adalah jenis virus hepatitis A, B, C, E, dan TT. Virus Hepatitis A (VHA) termasuk virus RNA, keluarga Picornavirus genus Hepadnavirus, yang tidak berkapsul, berukuran 27 nm. Virus Hepatitis B (VHB) termasuk virus DNA, genus Hepadnavirus, berukuran 42 nm, terdiri atas bagian inti (core) dan kapsul (envelope). Virus hepatitis C (VHC) merupakan virus RNA, termasuk Flavivirus, berukuran 30-60 nm. Virus hepatitis E (VHE) merupakan virus RNA, berukuran 32-34 nm. Virus hepatitis TT (VHTT), merupakan virus DNA, termasuk Circoviridae, tidak berkapsul, terdiri atas DNA untai tunggal, berukuran 30-50 nm. ²

4. Bagaimanakah virus-virus tersebut menyebabkan hepatitis?
Cara penularan virus-virus hepatitis tersebut dapat terjadi melalui beberapa cara yang tidak sama. Transmisi infeksi VHA dan VHE dapat terjadi melalui air yang tercemar (tinja penderita), secara enterik, sebagai “fecal-oral” atau “water-borne“. Transmisi VHB melalui produk darah dan cairan tubuh dengan cara suntikan, transfusi darah atau produk darah (parenteral), kontak seksual dan sewaktu lahir (perinatal); VHC melalui cara parenteral, dan mungkin perinatal; VHTT serupa dengan VHB.

Gambaran klasik hepatitis virus terdiri dari masa inkubasi, gejala prodromal, masa klinis kuning (ikterus, jaundice), lalu masa penyembuhan. Secara umum dari gambaran klinis sukar untuk membedakan hepatitis virus yang satu dari yang lain bahkan juga dari hepatitis yang disebabkan oleh penyebab lain. Semua virus hepatitis bereplikasi di hepatosit.
Pada akhir masa inkubasi dan fase pra ikterus VHA ditemukan juga di saluran empedu, darah dan tinja. Umumnya bersifat sembuh sendiri (self-limited) dan jarang menjadi kronis.
Pada infeksi VHB di dalam darah pasien mungkin dapat dijumpai adanya partikel VHB, partikel sferis dan tubular. VHB sendiri dianggap tidak sitopatik. Perjalanan penyakitnya bervariasi, dapat akut, fulminant, kronis, sampai tidak aktif, tergantung pada respons imunitas selular dari pejamu (host) dan dipengaruhi oleh usia. Hipotesisnya adalah limfosit T akan melisiskan hepatosit yang terinfeksi oleh VHB. Bila reaksi amat kuat terjadi bentuk klinis fulminant, bila reaksi cukup terjadi bentuk klinis akut, bila reaksi tidak cukup terjadi bentuk klinis kronis dan bila reaksi kurang atau tiada maka menjadi bentuk klinis tidak aktif (dahulu disebut pembawa virus asimtomatis atau pembawa “sehat”). Perjalanan penyakit seseorang yang terinfeksi oleh virus hepatitis B dapat dilihat pada gambar 1.

Gambar 1. Perjalanan penyakit bila terinfeksi virus hepatitis B. ²

Hepatitis akut dapat sembuh atau menjadi bentuk fulminant yang sering menyebabkan kematian atau menetap. Bila menetap dapat menjadi hepatitis kronis yang akan menyembuh atau berlanjut menjadi sirosis dan hepatoma atau menjadi pembawa virus sebagai bentuk tidak aktif. Ada perbedaan perjalanan penyakit hepatitis virus B antara bayi, anak dan dewasa. Bila terinfeksi oleh VHB sewaktu sudah dewasa/tua maka 90% akan menjadi akut dan hanya 10% akan menjadi kronis, sebaliknya bila terinfeksi sewaktu bayi/anak maka makin muda usia makin banyak yang menjadi kronis. Proses masuknya VHB ke dalam hepatosit lalu bereplikasi menjadi banyak dan kemudian keluar VHB baru dari sel hati dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2. Replikasi VHB di dalam sel hati. ³

Fase yang penting adalah terbentuknya covalently closed circular DNA (cccDNA) di hepatosit yang akan menetap sehingga sewaktu-waktu dapat kambuh.

5. Bagaimanakah membedakan jenis virus hepatitis?
Jenis-jenis virus hepatitis tersebut dapat dibedakan berdasarkan susunan virus utuh, atau unsur-unsurnya (RNA/DNA, enzim, atau antigen) dan juga antibodi yang dibentuk oleh tubuh pejamu sebagai hasil reaksi imunitas humoral. Semuanya dinamakan penanda serologik virus hepatitis yang khas untuk masing-masing jenis virus.

VHA mengandung antigen HAAg yang merangsang respons imun humoral menghasilkan antibodi anti-HAV; pada awal dibentuk kelas IgM yang dominan sampai 6-12 bulan kemudian IgG yang dominan pada masa konvalesen sampai bertahun-tahun kemudian dan memberikan imunitas.

Struktur VHB dapat dilihat pada gambar 3 dan 4. HBV DNA terdiri dari 2 untai: Untai yang di sebelah dalam, (+), berupa lingkaran tak lengkap, dan untai di sebelah luar, (-), berupa lingkaran lengkap. Untai (-) berfungsi menyandi protein dengan 4 daerah penyandi (open reading frame = ORF), yaitu surface (S), core (C), polymerase (P), dan gen X (X). Keempat ORF dikontrol oleh 4 promoter (preS1, preS2, core dan X), dan 2 enhancer (Enh I and Enh II). Terhadap 3 jenis Ag VHB, yaitu HBsAg, HBeAg and HBcAg, respons imun humoral dari pejamu membentuk 3 jenis Ab yaitu anti-HBs, anti Hbe, dan anti-HBc (kelas IgM pada fase akut dan kelas IgG pada masa bertahun-tahun setelah itu). Selain itu juga ada DNA virus (HBV-DNA) dan enzim DNA-polymerase.

Gambar 3. Virus hepatitis B dengan benda sferis dan tubular. ¹

Gambar 4. Struktur genetik VHB. ¹

VHC tersusun sebagai RNA untai tunggal. Pada ujung 5′-UTR terdapat reseptor untuk pengikatan pada ribosom (internal ribosomal entry site = IRES) yang penting untuk replikasi virus. Pada coding region terdapat daerah Open Reading Frame (ORF) yang berfungsi menyandi asam amino, yaitu protein struktural (Core (C), Envelope (E) / dan 2, protein p7), dan protein non-struktural (NS 1, NS2, NS3, NS4, NS5a dan Ns5b). Daerah NS memiliki kapasitas ensimatik (protease, helicase, RNA-dependent RNA polymerase). Terhadap HCV-RNA respons imun humoral tubuh membentuk anti-HCV.
Penanda VHE adalah HEVAg dan anti HEV, kelas IgM dan IgG. Diagnosis VHTT, dengan deteksi TTV-DNA. Penanda untuk VHE dan VHTT umumnya belum tersedia.

6. Bagaimanakah memilih jenis penanda serologik virus hepatitis pada berbagai keadaan?

Bila tersangka Hepatitis Akut, diperiksa penanda serologik terhadap virus hepatitis A, B, C, E dan TT berdasarkan kemungkinan terbesar. Pada anak dan dewasa muda terhadap VHA dahulu. Pada wabah melalui makanan yang tercemar kemungkinan VHA dan VHE. Pada risiko terkontaminasi darah atau produk darah diperiksa VHB dan VHC.
Hepatitis A akut didiagnosis dengan IgM anti-HAV. Lihat gambar 5.

Gambar 5. Pola perubahan penanda serologis pada hepatitis A. ⁴

Hepatitis B akut, mempunyai pola perubahan petanda serologis yang klasik yaitu munculnya HBsAg pada masa inkubasi, diikuti oleh anti-HBc kelas IgM lalu IgG, kemudian HBeAg dan HBV DNA serta polimerase DNA. Serokonversi HBeAg menjadi anti-HBe, bersamaan dengan tidak terdeteksinya lagi HBV DNA dan polimerase DNA, diikuti perbaikan klinis dan ALT. Setelah beberapa waktu timbul anti-HBs yang bermakna sudah sembuh dan imun. HBsAg merupakan penanda serologis yang paling relevan menunjukkan adanya infeksi yang sedang berlangsung. Pada masa konvalesen (penyembuhan) terdapat penurunan kadar HBsAg. Anti-HBs muncul setelah resolusi hepatitis B dan dalam serum subyek yang divaksinasi terhadap VHB. Biasanya anti-HBs titer >10 UI/L dihubungkan dengan imunitas dengan nilai duga positif (positive predictive value = PPV) sekitar 97%. Lihat gambar 6.

weeks after exposure
Gambar 6. Pola perubahan penanda serologik pada hepatitis B akut. ⁵

IgM anti-HBc titer tinggi, merupakan penanda infeksi akut VHB tetapi titer rendah juga didapatkan pada hepatitis kronis. IgG anti-HBc adalah penanda serologis sepanjang hidup (lifelong) dari infeksi VHB sebelumnya sebab menetap dan dapat dideteksi baik pada kasus infeksi kronis dan atau setelah resolusi infeksi akut. HBeAg selalu dideteksi selama infeksi akut VHB dan dihubungkan dengan replikasi virus akut dan derajad infeksi tinggi. Bersihan atau menghilangnya HBeAg diartikan serokonversi menjadi anti-HBe dan turunnya kadar HBV DNA. Pengukuran kadar (kuantitasi) HBV-DNA dianggap sebagai “state of the art” untuk menilai replikasi VHB. Biasanya penurunan kadar HBV-DNA serum diartikan dengan perbaikan parameter biokimia dan histologis.

Hepatitis C akut didiagnosis dengan adanya peningkatan ALT; anti-HCV negatif belum dapat menyingkirkan kemungkinan infeksi VHC sebagai penyebab. Deteksi tercepat adalah dengan HCV-RNA, sedangkan anti-HCV dapat dideteksi kemudian. Lihat gambar 7.

Gambar 7. Pola infeksi virus hepatitis C. ⁴

Dengan uji generasi pertama deteksi anti HCV lambat, baru positif setelah beberapa bulan terinfeksi, tetapi dengan uji generasi yang baru yang makin baik maka deteksi lebih awal. Pada umumnya hepatitis C bersifat kronis.

Gambar 8. Pola infeksi virus hepatitis E. ⁴

Terhadap hepatitis E akut, diperiksa anti-HEV IgM. Pola perubahan penanda serologik, gejala dan parameter ALT seperti dilihat pada gambar 8

Tersangka hepatitis kronis dihubungkan dengan infeksi VHB dan VHC, sedangkan untuk VHA dan VHE diangggap tidak ada bentuk kronis. Pada hepatitis B kronis, pola perubahan seperti pada gambar 9.

Months after exposure
Gambar 9. Pola perubahan hepatitis B kronis. ⁵

Per definisi bila setelah hepatitis akut kelainan menetap lebih dari 6 bulan, berupa peningkatan ALT, atau HBsAg, atau adanya HBV-DNA dengan cara non-PCR. Menetapnya HBeAg menunjukkan infeksi VHB menjadi kronis. Pada fase akut HBsAg +, HBeAg +, kadar HBV DNA tinggi dan ALT normal atau meningkat ringan. Pada fase immunoactive HBV DNA menurun, ALT meningkat, dapat terjadi flare yang diikuti dengan serokonversi HBeAg menjadi anti-HBe.
Terhadap hepatitis C kronis, dalam darah dapat dideteksi HCV-RNA, juga anti-HCV. Pengukuran HCV-RNA merupakan baku emas pada infeksi VHC baik akut maupun kronis. Lihat gambar 7.

7. Bagaimana menafsirkan hasil pemeriksaan penanda serologik virus hepatitis?
Pada pasien yang terinfeksi VHB dengan HBeAg positif ada 4 tingkat infeksi kronis. Tiap tingkat dapat berlangsung selama beberapa tahun. Lihat gambar 10.
Fase pertama adalah fase toleransi imun. Pada awalnya, terutama bila infeksi terjadi in utero atau sewaktu lahir, terdapat viremia kadar tinggi (10⁶ – 10⁹ genom/ml) tanpa kelainan biokimia atau histologis. Fase kedua adalah fase bersihan imun dimana viremia dan HBeAg-emia berlanjut disertai peningkatan inflamasi nekrosis hepatosit. HBV DNA dapat dideteksi pada kadar 10⁵ – 10⁷ genom/ml. Proses hepatitis nekroinflamasi dapat sedemikian kuat hingga terjadi bersihan hepatosit yang terinfeksi, HBeAg menghilang dan terbentuk anti-HBe.

Gambar 10. Tingkat penyakit pada infeksi VHB dengan HBeAg positif. ⁶

Fenomena ini disebut “HBe antigen/antibody seroconversion“. Namun bila proses berlanjut, dapat terjadi sirosis. Setelah serokonversi, inflamasi mereda disertai perubahan histologis dari hepatitis aktif menjadi normal, atau sirosis aktif menjadi tidak aktif. Laju serokonversi spontan terjadi 5–10% per tahun. Fase ketiga adalah fase kontrol imun (pembawa HBsAg tidak aktif), melanjutkan serokonversi HBeAg/anti-HBe, terus memproduksi HBsAg sebab sekuens integrasi DNA virus didalam DNA sel pejamu, tetapi replikasi VHB dikendalikan oleh respons imunitas selular pada kadar <10⁵ genom/ml. Pada hati mungkin histologis normal, hepatitis minimal atau sirosis tidak aktif, dan biokimia darah mungkin normal. Walaupun HBeAg negatif dan HBV-DNA kadar rendah, cairan tubuh pasien tetap dianggap infeksius. Sebanyak 60% pasien di praktek umum berada pada fase ini. Viremia dan hepatitis tanpa HBeAg mungkin menyusul, mencerminkan munculnya (escape) strain virus yang HBe-negatif (pre-core atau core promoter mutant) dari kontrol imun. Selama fase keempat ini ALT meningkat dan HBV-DNA dapat dideteksi pada kadar >10⁵ genom/ml, tetapi HBeAg tetap negatif. Hepatitis yang terus berlangsung dapat menuju sirosis. Pada fase kedua dan keempat penyakit ini, ketika kadar viremia >10⁵ genom/ml, hepatitis dapat menyebabkan fibrosis yang progresif. Penyakit yang tidak progresif, misalnya pada fase ketiga, disifatkan oleh ALT normal, HBV-DNA serum <10⁴ kopi/ml. Kadar HBV-DNA 10⁴ and 10⁵ kopi/ml berada pada daerah tidak pasti. Perlu dicatat bahwa pada populasi Asia dan Mediterania fase kedua dapat meloncat ke fase keempat tanpa melalui fase ketiga. Tidak mudah untuk menentukan fase seseorang pasien.

Penafsiran hasil (interpretasi) penanda serologis VHB dapat dilihat pada tabel 1 dan 2.

Tabel 1. Penafsiran penanda serologis VHB1

Untuk menentukan status infeksi dan daya tular perlu diperiksa HBeAg dan anti-HBe. Dalam hepatosit HBV-DNA berada dalam 2 bentuk, sebagai virus yang bereplikasi atau berintegrasi dengan DNA pejamu (nonreplicative). Pada pasien dengan HBeAg positif, serokonversi menjadi anti-HBe positif khas berkorelasi dengan hilangnya HBV-DNA dari sirkulasi bila diperiksa dengan cara non-PCR, parameter kimia menjadi normal, perbaikan histoptologik, keadaan replikasi rendah dan perbaikan klinis. ⁹
Perlu dibedakan antara inactive HBsAg carrier state (HBsAg +, anti-HBe+, HBeAg-, HBV-DNA tidak terdeteksi / rendah, ALT normal, histopotologik tiada nekro-inflamasi atau rendah dan tiada fibrosis atau ringan) dengan HBeAg-negative chronic hepatitis (HBsAg+, anti-HBe+, HBeAg-, HBV-DNA dapat dideteksi dengan cara non-PCR, ALT meningkat, biopsi hati menunjukkan nekroinflamasi). Keaktifan ALT dan titer HBV DNA dapat berfluktuasi. Pembedaan 2 keadaan ini dilakukan dengan titer HBV-DNA, sebagai batas titer 105 kopi/ml, yaitu batas kepekaan cara non-PCR. Pengukuran titer HBV-DNA dengan cara PCR dapat memberikan informasi lebih banyak.

Tabel 2 . Pola serologis yang khas pada infeksi VHB. ⁷

8. Apakah kesukaran yang mungkin dijumpai sewaktu menafsirkan hasil pemeriksaan penanda serologik virus hepatitis?

Pada pemeriksaan penanda serologik virus hepatitis, walaupun sudah dikerjakan dengan baik, masih ada kemungkinan diperoleh hasil yang tidak sesuai dengan pola yang umum. Beberapa kemungkinan yang dapat menjadi penyebabnya adalah antara lain adanya mutant dan infeksi tersembunyi (occult).
Mutant

Gambar 11. Mutasi pada virus hepatitis B

Pada infeksi virus VHB yang alamiah (wild type) didapatkan HBV-DNA +, HBeAg +, anti-HBe – dengan ALT meninggi dan bila terjadi serokonversi menjadi HBeAg – , anti-HBe + dengan ALT yang normal. Tetapi pada mutant VHB, yang terkenal adalah mutasi titik (point mutation) pada daerah precore region (G1896A), menyebabkan sintesis HBeAg terganggu (defective) melalui kreasi stop codon. Ini menyebabkan VHB tidak membentuk HBeAg, sehingga didapatkan HBV-DNA +, tetapi HBeAg -, anti-HBe+ dan ALT tetap tinggi, dinamakan hepatitis B kronis HBeAg-negatif. Hal ini dijumpai pada YMDD mutant pada pengobatan dengan lamivudine. Mutasi VHB dapat terjadi pada beberapa lokasi seperti core, pre-core dan pre-S/S gene. Lihat gambar 11.

Kelainan infeksi VHB tersembunyi (occult)

Kelainan ini biasanya disebabkan penekanan yang kuat terhadap replikasi virus dan ekspresi gen. Mekanismenya belum ditetapkan, banyak bukti adanya peran sistem imun. Pada pasien dengan koinfeksi VHC juga mungkin menekan keaktifan VHB. 8

Keadaan infeksi VHB tersembunyi (occult) bila HBV-DNA positif tetapi HBsAg negatif, dijumpai pada beberapa keadaan klinis, antara lain bila ada koinfeksi dengan VHC, terutama pada mereka dengan anti-HBc positif. Kadar HBV DNA rendah dan laju replikasi rendah namun deteksi HBV DNA dapat dihubungkan dengan peningkatan (flare) ALT yang dihubungkan dengan fibrosis/sirosis lanjut. Selain peran sistem imun juga ada peran faktor lain yaitu mutasi VHB dan koinfeksi dengan VHC. ⁷

Di Taiwan, Mu SC dkk mendapatkan ada 10.9% dari anak-anak yang mendapat vaksinasi terhadap VHB menunjukkan HBV-DNA positif titer rendah (rerata 1.6×104 kopi/ml) dan digolongklan pada infeksi VHB occult. Analisis sekuens gen S menunjukkan varian C139S mutant escape vaccine, variasi dan delesi didapatkan pada region pre-S. ⁹

Gambar 12. Model peran sistem imun pada hepatitis B tersembunyi (occult). ⁷

Salah satu penyebab utama reaktivitas positif palsu adalah keaktifan nonspesifik limfosit-B prematur yang menghasilkan molekul terkait IgA atau IgM tanpa didahului dengan paparan terhadap VHB. Praperlakuan sampel serum dengan bahan pereduksi misalnya dithiothreitol atau kalium bisulfit memperbaiki secara bermakna spesifisitas penetapan anti-HBc. Hasil tunggal (isolated) anti-HBc sering dijumpai pada pengguna obat intravena, orang de-ngan HIV, koinfeksi VHB dan VHC dan pe-rempuan hamil. Adanya anti-HBc positif tunggal sering ditafsirkan sebagai bukti adanya infeksi VHB pada masa lampau dimana HBsAg telah menurun di bawah batas deteksi. Namun 10% – 40% dari orang dengan pola serologis tersebut ter-nyata pembawa kronis VHB. Penyebab HBsAg negatif dengan hanya anti-HBc positif diduga karena HBsAg mungkin bersembunyi di kompleks imun beredar atau variasi di pre-S, atau mutasi di surface anti-gen sendiri dan khususnya di bagian penentu a (a determinant) yang dikenali oleh anti-HBs, dapat menyebabkan HBsAg tidak terdeteksi oleh cara konvensional. Kemungkinan interferensi sintesis HBsAg oleh infeksi VHC (65.4%) dan penyimpangan hasil pemeriksaan anti-HBs (14.4%). Sebagian dari orang dengan hanya anti-HBc positif mungkin pembawa HBsAg kadar rendah yang tidak terdeteksi. Kemungkinan adanya mutant tidak dapat disingkirkan. ¹⁰

Pemeriksaan penanda serologis
Metoda pemeriksaan penanda serologis virus hepatitis mula-mula dikerjakan pada tahun 1970-an dengan cara Radioimmunoassay (RIA), lalu setelah tahun 1980-an dengan cara Enzymeimmunoassay (EIA), setelah 1990-an banyak pula dengan cara electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) dan cara Polymerase chain reaction (PCR) dengan kepekaan (sensitivity) dan kekhasan (specificity) yang makin baik.
Rentang dinamis dari banyak diagnostik komersial untuk HBV-DNA bervariasi sekali dan hanya pengukuran real time yang baru yang mencakup seluruh rentang nilai-nilai HBV-DNA yang diamati dalam semua kondisi klinis dari infeksi akut sampai pembawa dengan titer rendah. Kini sudah ada pembakuan pengukuran HBV DNA berdasarkan standard WHO dan hasilnya dalam International Units (IU)/ml sehingga dapat membandingkan hasil yang didapat dari pengukuran yang berbeda. Rentang sensitivitas linier dari 102 sampai 1011 kopi (genom/ml)(real-time PCR). ^9,10

Pengukuran HBsAg kuantitatif
Pada pasien dengan hepatitis B kronis penanda yang terpenting untuk replikasi virus adalah HBeAg dan HBV-DNA kuantitatif. Di Italia lebih dari 90% pasien HBeAg negatif. Pengukuran HBV-DNA diperlukan untuk membedakan pembawa tidak aktif dari hepatitis kronis, namun pengukurannya sulit dan mahal. Pemeriksaan HBsAg sederhana dan tidak mahal, hubungannya dengan HBV DNA beredar dan penanda serologik lain sudah ditetapkan, hubungan kuat dengan cccDNA intra-hepatik, cadangan replikasi VHB pada pasien yang terinfeksi kronis. Tersedianya pengukuran kuantitatif HBsAg yang harmonis dengan standard WHO amat membantu penatalaksanaan pasien hepatitis kronis, dianjurkan pada awal pengobatan dan selanjutnya tiap bulan sedangkan pengukuran HBV-DNA tiap 3–6 bulan atau bila ada perubahan bermakna pada kadar HBsAg. ¹¹